TUNEL 染色

简介

TUNL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或调亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰东组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

原理

细胞调亡时，细胞内特异性的核酸内切酶活化，从而切割染色质DNA,使DNA分子断裂产生3'-OH末端。在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的作用下，可将荧光素-dUTP标记到DNA未端，从而可以通过荧光显微镜检测细胞凋亡水平。

材料与仪器

主要试剂：TUNEL试剂盒（诺唯赞 A113）、二甲苯、无水乙醇、1×PBS、DAPI（SIGMA-ALDRICH D9542，无菌去离子水配制成 5mg/mL 的母液，分装后-20°C冻存）、防荧光淬灭封片液 VECTASHIELD Mounting Medium（VECTOR H-1000）

主要仪器：荧光显微镜、移液器、枪头、湿盒、恒温箱

步骤（请根据不同品牌试剂盒的说明书操作）

石蜡切片脱蜡处理

1、 烤片：切片竖插在玻璃缸中，烘箱中 60°C×1h（此时肉眼可看到石蜡熔化流下），转移

到通风橱中，趁热直接置入二甲苯。

2、 脱蜡水化（在通风橱中操作）：

二甲苯I/II各 10min；

乙醇：从无水乙醇→无水乙醇→95%→80%→75%  各5min 。

3、 PBS 洗片：5min×3 次。用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。

注意：在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

以下步骤中，如非特别说明，组织上滴加的液体均按 50μL/组织计，如果组织面积大，50μL/组织不足以充分覆盖组织，那么需要按比例增加液体体积。

透化
1、 按 1:100 的比例，用 1×PBS 稀释 Proteinase K 溶液（2mg/mL），得到浓度为 20μg/mL的工作液；
2、 阻水笔画圈，每个样本滴加 50 μL Proteinase K 工作液，注意充分覆盖全部样品区域，室温孵育 20min；

注意：Proteinase K通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险，过短则可能造成通透处理不充分，影响标记效率。为得到最好的结果，可能需要优化Proteinase K的孵育时间。
3、 PBS 洗片 5min×3 次。用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。

注意：在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

阳性样本制备

用DNase I处理样品可以使样品细胞中的染色质DNA断裂，产生许多可标记的3'-OH末端，因此可使用DNase I处理样品的方法来准备阳性对照。

1、按1:l0的比例将10×DNase I Buffer稀释成l×DNase I Buffer,每个组织准备100uL,如果组织面积大，需要按比例增加：

2、滴加50uL1×DNase I Buffer到已经通透好的样木上，室温平衡5min；

3、用1×DNase I Buffer稀释DNase I (2U/uL)为20U/mL的工作液：

4、轻轻吸掉多余液体，每个组织滴加50uL浓度为20U/mL的DNase I工作液，室温孵育10min:

5、PBS洗片，5min×3次。

注意：DNase I处理过的阳性样本必须使用单独的染色缸进行PBS清洗和后续操

作，否则阳性对照上残留的DNase I可能会影响其他样品，导致假阳性。

标记及检测
1、 按 1:5 的比例使用去离子水将 5×Equilibration Buffer 稀释成 1×Equilibration Buffer；
2、 每个组织上滴加 50μL 1×Equilibration Buffer，并充分覆盖，室温平衡 30min；
3、 平衡期间避光按比例配制如下标记液：

4、 平衡结束后，用吸水纸吸掉1 × Equilibration Buffer。

注意：避免干片，吸水纸不要碰到组织，要避光处理。

5、  将配制好的标记液滴加在组织上，每个组织上滴加 50μL，注意充分覆盖，于湿盒中37°C避光孵育 1h；
5、 避光，PBS 洗 5min ×2-3 次。

DAPI 复染
1、 轻轻样本周围及背面的PBS溶液，每个组织加 100-200μL 工作浓度为 0.0025mg/mL DAPI 染色液（5mg/mL 母液以无菌去离子水 1:2000 稀释），室温避光孵育 5min（以荧光显微镜拍照）。
注意：如果使用激光共聚焦拍照拍照，可以将 5mg/mL 母液以无菌去离子水 1:200稀释，室温孵育30min。
2、 PBS 避光洗片 5min。

注意：延长 PBS 洗片时间将减弱 DAPI 染色效果。所以如果样品多，在 DAPI 染色后可以洗一片封一片。

封片
使用防荧光淬灭封片液封片。

立即拍照或者 4°C湿盒中避光保存。

染色结果

DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色。只在凋亡的细胞核中才有荧光素掺入而产生的特异的荧光。