石蜡及冰冻切片

石蜡切片一种是通过取材、固定、洗涤、脱水、透明、包埋、切片、摊片烤片、染色和封片等流程将组织制备成切片的技术。这是目前组织病理学制片中最常用的制片技术。

一、实验材料

动物组织，4%多聚甲醛（PFA），PBS，ddH2O，二甲苯，梯度乙醇，石蜡，石蜡包埋机。

二、实验步骤

1、取材：针对各组织部位规范化取新鲜组织，并用刀片单向切割成约3-4mm大小组织块，不要超过5mm。

2、固定：将切好的组织块放入4%多聚甲醛（PFA）或10%中性甲醛中固定，以组织块与4%多聚甲醛体积比 1：7为宜。PFA最好现用现配，一般在4度固定24~48h即可，固定时间因组织而异。冰冻切片可以直接用丙酮固定。其他固定液比如缓冲福尔马林PBS配的福尔马林含有K+和Na+，PH=7.4。

固定的原理：采用蛋白质凝固剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。

3、洗去PFA：固定完毕后，流水冲洗3次，每次5分钟。

4、脱水透明：此步骤应根据不同组织设置合适时间，基本流程如下

脱水：30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇（关键步骤：可当日2H也可过夜）→95%乙醇1→95%乙醇2→无水乙醇（根据不同组织大小和类型调整脱水时间）

透明：50%乙醇+50%二甲苯→二甲苯1→二甲苯2→二甲苯3

利用透明剂即可以和脱水剂相混合又能和石蜡相混合的特性，可以将脱水剂替换出来，并引入石蜡到组织中。二甲苯易挥发并且有毒，该步骤在通风橱中进行。

透明过程中及时观察组织形态调整透明时间，在光照下观察组织是否透明成功，透明适度即可，一般透明时间约为5min-30min。透明后放入小塑料盒子里做好标记。

5、浸蜡：将石蜡融化，温度保持在55℃左右。一共需要过三遍蜡。因第一次组织含二甲苯过多，第一次浸蜡时间尽可能短约15分钟，后两次可适当延长至30min-1h。该步骤的蜡纯度质量要求不高，但是要注意该步骤石蜡的熔点为54-56℃。

6、包埋：将组织块放入盛有蜡液的模具中，所需组织切面与底部平行，因蜡液在冷环境中易凝固，此步尽量要快。包埋用的石蜡因为要用于切片，对其质量和纯度和硬度的要求比较高，一般采用徕卡高熔点58-60℃的片状石蜡。

包埋在包埋机上进行，包埋机有60℃的工作台和-10℃的工作台，顶部是融化后的徕卡高级石蜡，从出蜡头按压出蜡。

蜡液凝固虽然很快，但是刚凝固的蜡不好切，最好在四度冰箱放置过夜后再进行切片。蜡块可在4度储存很久。
7、切片：使用切片机切片，不同组织厚度参考：肝肺心：4-6um，常规：4um，淋巴结，肾：2um。刀片锋利，使用时千万小心。

注意事项：软组织冰冻一下再切，硬组织加热后再切。
8、展片：切好的片段用毛笔小心转移到38-40℃的展片台内的清水上，待几分钟后切片完全没有褶皱，选择组织形状完整并且没有刀痕的片子进行捞片，一个片子可以捞上两片。使用黏附载玻片，吸附能力更强。

9、烤片：放入60度烘箱内烤片，烤片过夜，取出后常温保存备用。

冰冻切片
冰冻片常采用液氮法制备，具体做法如下：
1.包埋切片
① 将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天沉底，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
② 取出组织，预冷PBS清洗后平放于软塑瓶盖或特制小盒内（比如用铝箔纸折成有口的方盒）。
③ 加入适量OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

④ 取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。