双荧光素酶报告基因

　　双荧光素酶报告基因实验是指利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转化烟草，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转化，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

实验原理

　　将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光素酶报告系统。

实验实例

　　将RAW细胞用RPMI1640+Ceg培养基传代培养后，铺入12孔板中，24H后将不同质粒转入细胞中，继续培养48-72小时后收集细胞，向细胞样本中加入细胞裂解液，再将裂解后的细胞样本和萤火虫荧光素酶底物或海肾荧光素酶底物加入特殊反应板中，用酶标仪进行荧光检测。