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一．实验原理

Western Blot蛋白免疫印迹是对目的蛋白进行检测、分析以及定量的一种技术。将总蛋白样品通过SDS-PAGE，对不同分子量的蛋白质进行分离，再将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用特异性抗体（一抗）与膜上的靶蛋白进行特异性结合，再加入与一抗特异性结合带有标记的二抗(HRP/AP)，经过底物显色或放射自显影，检测生物样本中目标基因的蛋白表达情况。

二．实验步骤

1. 细胞或组织总蛋白的提取

1） 在冰上操作，往培养皿或培养孔板中，加入合适量RIPA细胞裂解液。

2） 将混合液转移到1.5mLep管中。

3） 将ep管插入冰中，超声裂解处理，再放置冰上裂解30min。

4） 高速离心：12000g，5min。

5） 将上清转移到另一ep管，取少许做蛋白定量。

6） 细胞样本可省去定量步骤，直接加入loading buffer混匀后，95°煮10min即可上样。

2. 蛋白样品的定量

利用BSA比色法调整蛋白浓度，使内参一致。

3. 蛋白样品PAGE电泳

电泳条件：80V-30min，再换110V

4. 转膜

转膜（湿转）操作方法

小心撬松预制胶的夹板，放于盛有转膜液的容器中,掀开夹板，切去凝胶四周多余部分后浸于转膜液；

参考Marker，确定目标蛋白条带在胶上的位置；

取适当大小PVDH膜（需用甲醇先浸泡激活3min）、滤纸、海绵置转膜液中浸泡；

按顺序安装转膜系统：转膜夹黑面（负极）-海绵-滤纸-凝胶-转印膜-滤纸-海绵-膜夹白面（正极），赶走气泡，插入盛有转膜液的转膜槽；

将转膜槽置冰水浴中，200 mA恒流转膜120min。

5. 封闭：转移结束后将PVDF膜取出，用1xTBST溶液配制的5%脱脂奶粉室温封闭1h。

6. 一抗孵育：倒去封闭液，加入一抗工作液（1:1000），于4°摇床上孵育过夜（16h）。

7. 漂洗：室温下于摇床上1xTBST清洗6次（每次漂洗8min)

8. 二抗孵育：将漂洗好的膜，放入1:10000稀释的二抗（HRP酶标记）溶液中，室温下在摇床上结合反应60min

9. 漂洗：室温下于摇床上1xTBST清洗6次（每次漂洗8min)

10. 显色：用ECL发光液(A液:B液=1:1)浇淋PVDF膜，放入凝胶成像系统成像。