RT-PCR检测

一、实验原理：

定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）以总RNA或mRNA通过酶逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行qPCR（Real-time qPCR）反应。qPCR在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测PCR过程中每一次循环扩增后产物量的变化，并通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

二、分类：

1、一步法与两步法：

一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。

在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

2、SYBR染料法与TaqMan探针法：

SYBR染料法常用SYBR Green I，它以非特异性方式结合在dsDNA双螺旋小沟区域，游离的SYBR Green I 只发出极弱的荧光信号，PCR过程中，当扩增生成dsDNA时，SYBR Green I 逐渐与dsDNA结合，荧光信号被千倍放大，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。

但SYBR Green I 与特异性扩增产物结合时还可以同引物二聚体、非特异性扩增的dsDNA结合，影响结果判断。所以扩增反应结束后，还必须对生成的dsDNA进行分析：即通过升温，dsDNA双链解开，SYBR Green I 染料脱落，荧光值逐渐下降，形成温度和荧光强度的曲线即“熔解曲线（Melting curve）”，由此判断体系中是否存在引物二聚体、非特异性扩增。

TaqMan探针法在扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

3、绝对定量与相对定量：

绝对定量检测是根据标准曲线对未知样品进行的定量。

相对定量用于分析特定样品相对于参照样品（比如，未处理的对照组）某个基因表达量的变化。用于相对定量的计算方法有标准曲线法和比较CT法。

三、实验流程：

1、将RNA逆转录成cDNA。

2、对cDNA进行qPCR扩增。

3、分析数据，统计作图。

四、结果示例：