蛋白免疫共沉淀（co-IP）

简介：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

原理：

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y、Z等也能沉淀下来。通过离心沉淀后，洗掉没沉淀的蛋白，用WB来检测一下拉下来的蛋白中X蛋白和Y、Z等蛋白的量，就能知道X蛋白和Y、Z等蛋白之间的结合互作情况了。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内存在相互作用而结合。

实验仪器及材料准备：

磁力架，“大风车”摇架，超声仪，水浴锅，待测细胞或组织，IP裂解液，ep管，pierce protein A/G magnetic beeds，D-PBS，蛋白上样缓冲液5x loading buffer。

实验步骤：

①样本制备

细胞样本：收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解，超声破碎，离心取上清。

组织样本：剪碎组织，按组织量加入裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆器匀浆，直至充分裂解，离心取上清。

②加入A蛋白的IP抗体

按照抗体网站推荐的使用比例，添加一定量的A抗体(能适用于IP实验),4℃轻柔混合过夜。

③免疫复合物沉淀

加入一定量的Protein A和Protein G,4℃温和地混匀1-3小时或过夜，离心保留沉淀，并清洗沉淀3次。

④洗脱与检测蛋白

根据样本的性质和下游检测手段，选择合适的洗脱缓冲液，使用洗脱缓冲液将互作蛋白复合物与珠子分离。接着进行下游检测实验。

结果分析：

该图为验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用的结果图。由图可以发现，该实验被分为两组：input组及IP组，有两块胶图，第一块是IB验证蛋白X的存在，第二块是IB验证蛋白Y的存在。由对照组的条带可以得到结论：蛋白X与蛋白Y都是存在的。IP组的第一个条带表示利用IgG进行沉淀实验，结果蛋白X与蛋白Y没有被沉淀下来，说明蛋白X、蛋白Y不能与IgG结合（阴性对照，用于排除蛋白与抗体非特异性结合的可能性）；IP组的第二条带表示利用蛋白X进行沉淀实验，结果蛋白X被沉淀下来，蛋白Y也被沉淀下来，由此得到结论：蛋白X-蛋白Y之间存在相互作用。