PKM2-K367-me2 抗体

PKM2-K367-me2

一、详细信息

背景介绍：Catalyzes the final rate-limiting step of glycolysis by mediating the transfer of a phosphoryl group from phosphoenolpyruvate (PEP) to ADP, generating ATP. The ratio between the highly active tetrameric form and nearly inactive dimeric form determines whether glucose carbons are channeled to biosynthetic processes or used for glycolytic ATP production. The transition between the 2 forms contributes to the control of glycolysis and is important for tumor cell proliferation and survival.By Similarity Isoform M2 Isoform specifically expressed during embryogenesis that has low pyruvate kinase activity by itself and requires allosteric activation by D-fructose 1,6-bisphosphate (FBP) for pyruvate kinase activity . In addition to its pyruvate kinase activity in the cytoplasm, also acts as a regulator of transcription in the nucleus by acting as a protein kinase.

· 制备方式：多肽路线

· 制备依据：合成修饰性多肽 GETA-(K-me2)-GDYP-C，偶联KLH用于免疫，纯化和检测，合成非修饰性多肽GETAKGDYP-C用于纯化和检测，额外合成单甲基化修饰性多肽 GETA-(K-me1)-GDYP-C 用于DB检测，若交叉反应不明显，则满足要求，如果交叉反应明显，则可用单甲基化修饰性多肽进行纯化。

· 推荐稀释比：WB1:500 - 1:2000

· 反应物种：Mus musculus (Mouse)

· 可用于：IP/Co-IP，WB

· 理论分子量：58kDa

· 实际分子量：58kDa

· 产品形式：液体

· 存储缓冲液：Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.

· Buffer: PBS with 0.01% thimerosal,50% glycerol,pH7.3.

· 阳性样本：293 T细胞

· 细胞定位：细胞质,细胞核

· 纯化方式：Affinity purification

二、蛋白免疫印迹实验步骤

1、样品制备

（1）细胞收集

· a. 贴壁培养细胞收集

· 用细胞刮刮下细胞或用胰酶消化处理后，300×g，离心5 min，弃上清；用适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬，4℃，300×g 离心5min,弃上清，重复清洗步骤一次收集细胞沉淀。

· b. 悬浮培养细胞收集

· 收集悬浮细胞，300×g离心5min，弃上清，适量冰PBS溶液将离心后细胞沉淀重悬，4℃，300×g 离心5min,弃上清，重复清洗步骤一次，收集细胞沉淀。

· c. 组织样本收集

· 把组织在预冷的表面上剪切成细小碎块，然后用液氮或超低温冰箱中冷冻组织30min以上，迅速加液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

（2）总蛋白提取

· a. 细胞/组织裂解：

· 根据收集的细胞数量、细胞种类添加适量的裂解液。

· 例如常规细胞沉淀可按照1mL裂解液/107个细胞的比例加入相应体积的裂解液，加入裂解液后将沉淀吹打混匀。使用细胞破碎仪超声样本，每次超声时间4-5s,间隔时间在5s左右，肉眼观察，样本为均一，不粘稠液体即可。或采用震荡裂解方式进行，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s，裂解20min。

· 组织碎片可按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎（裂解液中根据需要添加或不添加蛋白酶抑制剂）。所有理解过程，务必在低温条件下进行。

· b. 离心：

· 把裂解好的样品配平后，将裂解好的样本置于预冷的高速冷冻离心机中，13000×g离心10min，收集上清

· c. 蛋白变性：

· 吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入对应体积的5× Loading Buffer（最终工作液为1×)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。

（3）蛋白浓度测定（BCA法）

· a. BCA工作液的配置

· 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。

· b. BSA标准品梯度稀释

· 取10μl蛋白标准品（5 mg/mL BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1×PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl。

· c. 样本浓度测定

· 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。每孔加入 200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定样本和标准品在562nm下的吸光度，或在540-595nm之间波长下的吸光度。根据BSA蛋白浓度标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

2、凝胶电泳

（1）制胶器安装

· 根据使用说明书安装。

（2）凝胶配置

· 根据目标蛋白大小，选择不同合适浓度的分离胶。注意该过程注意不能有气泡产生。

（3）上样

· 待胶凝固好后，用移液器吸取样品垂直梳孔上样，建议总蛋白上样量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。

（4）电泳

· 上样完成后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数。建议浓缩胶电泳参数为恒压80V，分离胶采用恒压120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。

3、转膜

（1）准备工作

· a. 转膜缓冲液可提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。

· b. 根据胶的面积大小，将滤纸以及NC膜剪裁至合适尺寸。

· c. 建议目的蛋白大于20KD可选择0.45μm NC膜；目的蛋白小于20KD可选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜。选择完毕后将膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用。注意使用PVDF膜需先放入甲醇中浸泡至均匀浸透，没有白点即可放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。

（2）转膜

· 根据目的蛋白大小，选择合适的转膜条件。

4、封闭

· 转膜完成后，将膜取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入5%脱脂牛奶（TBST Buffer稀释），室温孵育1h，加入TBST Buffer洗涤3次，每次5 min。

5、抗体孵育

根据所使用的一抗种类，选择进行下述其中1项的具体步骤

（1）对于无偶联的一抗

· a. 将一抗用一抗稀释液按照抗体说明书推荐比例进行稀释,室温孵育1.5h或4℃过夜孵育。

· b. TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。

· c. 按一抗来源选取合适的HRP偶联二抗，按照合适比例进行稀释，室温孵育1h。

· d. TBST Buffer洗涤4次，每次5 min。

· e. 继续进行后续曝光操作。